عنوان : نقش روشهاي كروماتوگرافي در ميزان حذف شاخص HbsAg ويروس هپاتيت B از كنسانتره هاي فاكتور VIIفعال انعقادي

نويسنده ، نويسندگان : دكتر صالح نصيري ، دكتر حوري رضوان ، مجيد حيدري ، ساتيك تاروئيان

نشاني : تهران – تقاطع شيخ فضل الله نوري و شهيد همت – شركت پالايش و پژوهش خون

بخش تحقيقات – صندوق پستي 369 - 14665 - تلفن : 3 – 8278341 داخلي 263

مقدمه واهداف :

بيماري هموفيلي يكي از بيماريهاي شايع ژنتيكي وابسته به جنس مي باشد كه نقصان توليد فاكتور VIII انعقادي در آنها موجب خونريزي مي گردد . براي درمان اينگونه بيماران از كنسانتره فاكتور VIII استفاده مي شود . در گروهي از بيماران توليد آنتي بادي بر عليه فاكتور VIII تزريقي موجب عدم پاسخ دهي به درمان مي گردد . اينگونه بيماران مي توانند از داروهايي حاوي فاكتور VII فعال استفاده نمايند . اين مطالعه نشان مي دهد در طي مراحل تهيه كنسانتره هاي فاكتور VII انعقادي ، نقش روشهاي كروماتوگرافي به كار گرفته شده ، در ميزان حذف شاخص HbsAg ويروس هپاتيت B در كنسانتره ها چگونه بوده است ؟

روش اجرا :

دراين روش ماده اوليه با پلاسماي فرد آلوده به HbsAg مخلوط گرديد و با استفاده از مطالعات قبلي از ژلهاي DE - 52 سلولز ، DEAE - Sephadrose CL- 6 B , DEAE - Sephadex A 50 و CNBr- activated Sepharose 48 به روشهاي كروماتوگرافي و ايميونوافينيتي كروماتوگرافي كمسانتره هاي مختلف فاكتور VIII نعقادي جمع آوري و سپس با رقتهاي لكاريتمي ميزان حذف HbsAg در نمونه هاي نهايي و اوليه به كمك آزمايش ELISA محاسبه شدند .

يافته هاي پژوهش :

نتايج پژوهش نشان دادند كه روش ايميونوافينيتي كروماتوگرافي با استفاده از ژل ،

CNBr - activated Sepharose 48 ميزان log 2/3 در حاليكه روشهاي كروماتوگرافي تعويض يوني مانند سلولز ، سفاروز ، سفادكس به ترتيب log 7/1 و log 2/2 و log 7/2 توانستند ميزان HbsAg را در نمونه هاي نهايي كاهش دهند .

بحث و نتيجه گيري :

تجربيات ما نشان دادند كه نوع ژل ، سرعت عبور بافر ، نحوه جداسازي (PH و قدرت يوني ) حجم بافر شستشو دهنده و تعداد دفعات آن در روشهاي بكار گرفته شده ، ساختمان خارجي ويروس و واكنش آن با ژل از عوامل مهم در حذف ويروس مورد نظر در كنسانتره ها مي باشند .

نتايج حاصل نشان دادند كه روش ايميونوافينيتي كروماتوگرافي نسبت به ساير روشهاي تلخيص كروماتوگرافي در حذف شاخص HbsAg موثرتر عمل نموده و ژلهاي سفادكس ، سفاروز و سلولز بترتيب درمراحل بعدي اهميت قرار دارند .

Title of Article : Study of chromatographic methods in removal of HbsAg duting preparation of coagulation activated factor VII concentrates

Author(s) : Saleh Masiri Ph.D. , Houri Rezvan Ph.D. , Madjid Heydiari M.S.,Satik Tarouian B.S.

Address : R & D Depatment , Iranian Blood Research and Fractionation Co., Fazloolah Express way # Shahid Hemmat , Tehran , Iran .

Introduction & Objectives :

Haemaophilia is one of the prevalent X-linked hereditary disease with deficiency of factor VIII which causes bleeding in patients . Factor VIII concentrates are used for treatment of these patients but in some of patients factor VIII inhibitors developed and haemostasis is not achieved . Therefore , these patients use other therapeutic agents such as activated factor VII concentrates . This study shows the effects of chromatographic methods in reduction of HbsAg during preparation of factor VII concentrates .

Method :

In according to the pevious experiences in prepatation of factor VII concentrates ; stating materials were spiked with plasma of HbsAg positive donors and were chromatographed by the gels of cellulose DE-52 , DEAE-Sepharose CL-6B , DEAE-Sphadex A50 and CNBr-activated Sepharose 4B . Ten-fold dilution factors were prepared and ELISA tests for determination of HbsAg were carried out .

Results :

The results show that immunoaffinity chromatography with CMBr-activated gel can remove 3.2 log while othe ion-exchange gels such as Cellulose , Sepharose and Sephadex can eliminate 1.7 log and 2.7 log of HbsAg during preparation of concentrates .

Discussion & Conclusion :

Our experiments indicate that type of gel , flow rate , volume of washing buffer and the number of washing and elution steps , the process of purification (PH, ionic strength ) , type and structure of virus are important parameters which may influence the chromatographic behavior of viruses . In according to our results , immunoaffinity chromatography is more effective in removal of HbsAg than other ion-exchange chromatographic gels Sephadex , Sephatose and Cellulose which are less important respectively during preparation of factor VII concentrates and so they should be considered at the field of viral safety in plasma products .