عنوان : بهبود روش ها جهت سكوانس نمودن ژن PIG - A  در بيماران مبتلا به پاروكسيسمال ناكتورنال هموگلوبينيوري ( PNH)

نويسندگان : يوسف مرتضوي 1 ، تيم رادفورد 2، ادوارد گورد  -  اسميت 2

نشاني : 1 – عضو هيات علمي دانشگاه علوم پزشكي زنجان .

            2 -  بيمارستان سنت جورج دانشگاه لندن ، انگلستان .

 

PNH يك بيماري اكتسابي اختلال سلول بنيادي خونساز مي باشد كه به علت جهش سوماتيك در ژن PIG - A  ايجاد مي گردد . از آنجا كه اير بيماران در گردش خون علاوه بر سلولهاي معيوب ( جهش يافته )‌،‌داراي سلولهاي نرمال نيز مي باشند و نيز در بيماران مونث يك الل غير مبتلا بر روي كروموزم X  غير فعال وجود دارد ، لذا در  حال حاضر جهت آناليز سكوانس ژن از روشهاي ايجاد subclone   ,  Cell line   نمودن محصولات PCR  و سپس تعيين توالي نوكلئوئيدها در تعدادي از subclone   ها استفاده مي شود اين روشها موثر و كارا اما وقت گير و گران مي باشند

براي رفع اين مساله روشهاي بهتري را براي سكوانس نمودن مستقيم ژن با استفاده از نمونه هاي سلولي اين بيماران طراحي نموديم . براي اين منظور با استفاده از آنتي بادي منوكلونال Campath  - IG  ,  CD59   ( براي لنفوسيتها ) بيدهاي مغناطيسي (Beads  Immunomagnetic )  سلولهاي نرمال و بدون جهش را از نونه سلولي حذف و  سلولهاي جهش دار را جدا نموديم . پرايمرهاي ( آغازگر ) جديدي جهت تكير ژن PAG - A  توسط PCR  طراحي گرديد .

اين پرايمرها سكوانس  كد كننده (coding sequence)   ژن مزبور را در قطعات كوچكتري تكثير مي نمايند . اندازه قطعات PCR  براي (Conformation  Polymorphism Single Strand )  SSCP  كه روش پيداكردن جهش هاي ناشناخته است ، مناسب مي باشند .

با حذف نمودن قسمت هاي اضافي اينترون ، امكان ايجاد جهش هاي كاذب توسط SSCP  ( بعلت وجود پولي مورفيسم در اينترون ) را به حداقل رسانيديم . جهش هاي بزرگتر ( حذف و اضافه ) پس از الكتروفورز بر روي ژل آگارز ( Nu - Seive) شناسايي گرديدند .

باندهاي غير طبيعي DNA را مستقيما از ژل جدا نموده و پس از PCR  مجدد ، با استفاده از Cycle  Sequencing  مورد تجزيه و تحليل قرار داديم .

برخي از جهش هايي كه توسط SSCP قابل شناسايي نبودند ، توسط  Heteroduokex  شناسايي گرديدند .

با استفاده از اين تكنيك ها  جهش هاي موجود بر روي ژن PIG - A   بدون ايجاد Cell  line و بدون نياز به Subclone  نمودن محصولات PCR  در تعداد زيادي از بيماران PNH  قابل شناسايي مي باشد . 

 

 

 

Title of Article : IMPROVED TECHNIQUES FOR DIRECT SEQUENCING OFMUTATIONS WITHIN THE PIG-A GENE OF PATIENTS WITH PAROXYSMALNOCTURNAL OGLOBINURIA

Author(s) : Yousef Mortazavi 1 , Tim Rutherford 2 and Edward Gordon – Smith3

Address : Zanjan Medical School , pathology Department , Zanjan –Iran . 2- St . George’s Hospital Medical School , London , UK .

 

Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) is an acquired stem cell abnormality caused by somatic mutations in the PIG-A gene .

Because normal cells are usually also present in PNH  patients , and because affected female cells contain an unaffected allele on the inactive X-chromosome , sequence analysis has involved generation of clonal PNH cell lines , and /or subcloning of PCR products and sequencing of multiple subclones . These methods are effective but laborious . We have therefore developed improved techniques for direct se     quencing from primary PNH samples .

PNH cells were enriched by labeling with anti-CD56 or Campath-1G ( for lymphocytes ) and depletion of positive cells using immunomagnetic beads .

We have designed new primer pairs for the efficient amplification of PIG-A coding sequence from cellular DNA. The amplified fragments are of an appropriate size for efficient single strand conformation polymorphism (SSCP) electrophoresis without requiring restrictio ezyme digestion . By minimizing the intron sequence included , we have eliminated false positive SSCP tesults due to intron polymorphisms . Larger insertions and deletions were detected by Nu-Seive agarose gel electrophoresis . Abnormal bands were extracted directly from the gel and analysed by sysle sequencing using dye labeled terminators . Farmeahift and point mutations were detected by SSCP on silver stained MDE gels . We have demonstrated methods for extraction of mutant SSCP bands from the stained gels . After re-amplification these have been used for direct sequencing . It some cases mutations could not be detected by SSCP but vere detected by heteroduplex (HA) analysis . Since the heteroduplex is a mixed sequence , point mutations could not be cetermined by direct sequencing , but frameshifts could be identified by the appearance of “ambiguity” due to overlapping sequence . Thus , in the majority of cases, these methods allow the detectior of PIG-A gene mutations without the generation of cell lines , and without the need for subcloning of multiple PCR products .