عنوان : توليد آنتي بادي پلي كلونال بر عليه ايمونوگلوبولين هاي انساني ( معرف كومبس ) در خرگوش

نويسندگان : دكتر جعفر مجيدي ، دكتر محمدرضا بنيادي ، خانم معصومه فارغي

نشاني : تبريز – دانشگاه علوم پزشكي تبريز – دپارتمان ايمونولوژي – تلفن : 3361518

مقدمه و اهداف :

معرف كومبس يا آنتي هيومن گلوبولين ، آنتي بادي پلي كلونالي است كه در بدن حيواني مثل خرگوش وبر عليه سرم انسان يا فراكسيونهاي غني از ايمونوگلوبولين انساني توليد مي شود . اين معرف كاربردهاي آموزشي – تشخيصي متعدد دارد و در آزمايشات كومبس مستقيم ، غير مستقيم ، كومبس رايت و در بانك خون در تشخيص آنتي ژن Du مورد استفاده قرار مي گيرد . بعلاوه آزمايشات فوق براي كليه دانشجويان رشته هاي پزشكي ، داروسازي ، دندانپزشكي و پيراپزشكي آموزش داده مي شود كه در اين امر از كومبس تجارتي استفاده مي شود . لذا تصميم گرفته شد نسبت به توليد معرف كومبس در راستاي برداشتن گامي بيشتر درجهت خودكفايي و رسيدن به اهداف فوق اقدام شود .

روش اجرا :

براي توليد معرف كومبس ، سرم افراد انساني جمع آوري شده و به يكديگر مخلوط شد . سرم به نسبت يك به يك با بافر فسفات نمكي PBS با PH 7.4 رقيق شد رسوب دهي با نمك سولفات آمونيوم صورت گرفت . رسوب حاصله در برابر بافر فوق دياليز گرديد تا فراكسيون غني از ايمونوگلوبولين بدست آيد .

پس از محاسبه مقدار پروتئين موجود در فراكسيون در طول موج 80 نانومتر مقدار 300 - 200 ميكروگرم از فراكسيون غني از ايمونوگلوبولين با 300 ميكروليتر از ادجوانت كامل فروند مخلوط و ايمونيزاسيون خرگوش بطور عضلاني انجام گرفت . تزريق دوم همراه با ادجوانت ناقص و تزريق سوم بدون ادجوانت و به فواصل سه هفته از يكديگر انجام گرفت . در نهايت خونگيري از قلب خرگوش صورت گرفته و با استفاده از تست اخترلوني ( دابل ديفيوژن ) ايمن شدن خرگوش تاييد شد . تيتراسيون آنتي سرم خرگوش با استفاده از تستهاي كومبس مستقيم ، كومبس رايت و اليزا انجام گرفت .

يافته هاي پژوهش :

نتايج تست دابل ديفيوژن كه مبتني بر انتشار مضاعف آنتي ژن وآنتي بادي در ژل آگاروز بود نشان داد كه خرگوش بطور كامل ايمونيزه شده است و آنتي بادي حاصل در خرگوش با آنتي ژن تزريقي يك خط رسوبي واضح بوجود آورد نتايج تيتراسيون سرم با استفاده از تستهاي كومبس مستقيم ، غير مستقيم و كومبس رايت و اليزا در تاييد نتايج تست دابل ديفيوژن و قابل مقايسه با استاندارد خارجي بود .

بحث و نتيجه گيري :

نتيجه مي گيريم كه توليد معرف كومبس با توان عالي و با هزينه كمتر مقدور بوده و گامي در جهت خودكفايي كشور محسوب مي شود . بعلاوه محصول بدست آمده قابل استاندارد وقابل توزيع بصورت محلول پايدار مي باشد .

Title of Artlcle : Production of polyclonal antibody against human immunoglobulins ( cooms reagent ) in rabbit

Authors: Dr.jafar majidi – Dr.mohammadreza bonyadi – Miss masomeh faroghi

Address : Tbriz – University of medical sciences – Faculty of medicine- department of immunology

Tel : 3361017

Introduction & Objectives :

Coombs reagent or Anti-human globulin is a poly clonal antibody that , produced in an animal such as rabbit against human serum or immunoglobulin-tich fraction .This reagent is applied to teaching and diagnosis and also is useful in direct and indirect coombs and coombs wright test . Also we use coombs reagent for diagnosis of Du antigen in blood bank , In addition the above tests are taught to all of the medical , paramedical , dental and pharmacy students by using foreign commercial coombs reagent . So producing coombs reagent in the country would be a step towards self sufficiency .

Metod :

First different human serums were collected and mixed Then the mixturr was diluted with eqivalent volume of phosphate buffered saline (PBS) with PH 7.4 . Diluted serum was precipitated with sulphate ammonium salt . Then precipitant was dialysed against PBS until an immunoglobulin –rich fraction is yielded . The protein content of the fraction was calculated by measuring its absorbance at 280 nm wavelength . Then 200-300 ug of the Ig-rich fraction were mixed with 300 ul of compete ferund adjuvant (CFA) and injected to the rabbit . Second injection was done with incoplete ferund adjuvant and third without adjuvant .These injections were done every other three weeks . In the end rabbit’s heart blood was taken and by using okhterlony test ( double diffusion ) immunization of rabbit was confirmed . Then titration of rabbit antiserum (AHG) was done with direst and indirect coombs , coombs wright and ELISA tests .

Results :

Double diffusior results based on dual diffusion of antigen and antibody in agarese gel showed that rabbit has been completely immunized , because a precipitative line was produced from rabbit’s antibody with injected antigen . The res-ults of serum titration by using direct and indirect coombs wright and ELISA tests confirmed the result of double diffusion test and were comparable with foreign standards .

Discussion & Conclusion :

The conclusion is that producing of coombs reagent is economical and would be a step towards self sufficiency of our country . Besides the yield is in keeping with standards and distributable as a stable liquid .